Các vấn đề sự cố thường gặp trong phân tích bằng HPLC

Các máy HPLC thế hệ mới đều có hệ thống tự bảo vệ của riêng nó nên đừng hoảng hốt khi máy báo lỗi. Thay vì hốt hoảng, bạn hãy trả lời những câu hỏi theo trình tự sau đây:

1. Hệ thống của mình đang vận hành có phù hợp với mẫu sử dụng? Mẫu của mình có đảm bảo hay không?

2. Kiểm tra lại quy trình thực hiện của mình:

+ Quy trình có thực hiện đúng chưa?

+ Thiết bị của mình đã được thiết lặp phù hợp chưa?

3. Kiểm tra thêm các thông tin:

+ Lần cuối hệ thống hoạt động có đúng hay không?

+ Có điều gì thay đổi trong đó hay không?

4. Xem lại hết các yếu tố tổng quát:

+ Đôi lúc chúng ta không phải luôn có nguyên nhân rõ ràng.

+ Có phải đã có 1 điều gì (dù nhỏ nhất) đã thay đổi trong hệ thống phải không?

Đôi lúc chỉ những câu hỏi đó thôi đã giúp chúng ta tìm ra được câu trả lời cho sự cố của mình!

Hiểu về hệ thống: hiểu về hệ thống của mình đang sử dụng sẽ giúp cho ta cái nhìn sâu sắc hơn và dễ dàng nhận ra những sai sót hơn.

Một hệ thống HPLC gồm những thành phần sau:

1. Bơm.

2. Bộ tiêm mẫu/ tự động tiêm mẫu.

3. Cột.

4. Đầu dò.

5. Hệ thống dữ liệu/ thiết bị xuất tín hiệu.

Các bạn nên nhớ rằng đôi khi 1 sự cố có thể liên quan đến nhiều bộ phận khác nhau trong hệ thống HPLC.

I. Áp suất

Trong sắc ký lỏng hiệu năng cao thì áp suất có ảnh hưởng rất nhiều đến giá trị phân tích. Bên cạnh đó nếu xét về mặt kỹ thuật thiết bị thì áp suất ảnh hưởng lớn đến tuổi thọ của thiết bị. Vì vậy khi gặp các rắc rối về áp suất thì chúng ta cần phải giải quyết nó 1 cách toàn diện.

Khi nói đến vấn đề áp suất thì chúng ta sẽ gặp các hiện tượng sau:

+ Áp suất quá cao so với bình thường: đây là vấn đề thường gặp nhất ở các phòng kiểm nghiệm. Với hiện tượng này sẽ làm cho tuổi thọ của thiết bị chúng ta bị giảm ( các đường ống, van đóng mở, flow-cell,…), cột bị giảm tuổi thọ,… Ngày nay các hệ thống HPLC đều có hệ thống an toàn của riêng nó vì vậy khi gặp việc áp quá cao thiết bị sẽ tự ngắt đảm bảo an toàn thiết bị. Nhưng như vậy sẽ làm giảm hiệu suất làm việc của phong kiểm nghiệm. Thử nghĩ, chúng ta lên mẫu xong, định sẽ chạy qua đêm nhưng vì áp suất tăng đột ngột làm hệ thống bị ngừng. Thế là sáng hôm sau mình phải chạy lại từ đầu.

+ Áp suất thấp hơn so với bình thường: đây cũng là 1 vấn đề thường gặp ở các phòng kiểm nghiệm (dù ít khi gặp hơn). Vấn đề này có 2 nguyên nhân chính: thứ nhất là do lỗi của kiểm nghiệm viên – thiết lập bơm không đúng như quy trình; thứ hai là do hệ thống bị rò rỉ ở đâu đó. Ở nguyên nhân do kiểm nghiệm viên, chúng ta hãy kiểm tra lại quy trình và thiết lập của máy. Ở nguyên nhân thứ hai, mọi thứ sẽ khó hơn. Chúng ta phải kiểm tra trên phần mềm của máy xem có báo rò rỉ ở đâu module nào không – ở các dòng máy của Hitachi đều có trang bị tính năng này. Sau đó kiểm tra đường ống ở từng module, bắt đầu từ bơm, lên đến autosampler, column oven. Đôi lúc chúng ta phải nhờ đến hỗ trợ kỹ thuật bên nhà cung cấp – với dòng Chromaster và sản phẩm cung cấp bởi công ty 2H thì các bạn sẽ được hỗ trợ trong vòng 24 giờ từ lúc có sự cố – để tìm hiểu chổ rò rỉ ở đâu.

Nhận biết nguyên nhân gây ra áp suất cao và phương hướng giải quyết:

Kiểm tra áp suất của hệ thống khi có cột và khi không có cột trong hệ thống. Chúng ta thử gỡ cột ra và thay thế bằng ống mao quản và theo dõi áp suất của hệ thống. Điều này giúp ta phát hiển ra hệ thống đang bị nghẹt do hệ thống bên trong hay là do cột.

+ Nếu sau khi gỡ cột ra mà áp suất hệ thống vẫn cao. Có thể là hệ thống đường ống đã bị nghẹt. Chúng ta cần liên lạc với bảo trì của hãng để có thể đưa ra cách vệ sinh tốt nhất cho máy. Lưu ý rằng khi bên bảo trì của hãng xuống sữa chửa, chúng ta cần nhờ họ hướng dẫn chúng ta biết cách để sau này có thể giải quyết vấn đề tương tự.

+ Nếu gỡ cột ra mà áp suất hệ thống giảm xuống. Điều này chứng tỏ cột của chúng ta đang gặp vấn đề.

Khi bạn nghi ngờ áp suất hệ thống của mình tăng cao do cột sắc ký, rất có thể cột sắc ký của bạn đã bị nhiễm bẩn và cần phải được vệ sinh hợp lý. Sau đây là các bước tiến hành vệ sinh cột sắc ký của bạn.

Đầu tiên bạn tiến hành đảo đầu cột và rửa cột bằng chính pha động bạn đang chạy mẫu. Việc làm này giúp bạn có thể rửa những vết bẩn đã bám lên trên màng lọc ở đầu vào của cột. Đôi khi những vẫn đục lơ lửng trong mẫu cũng có thể làm bẩn và nghẹt màng lọc ở đầu cột của bạn và đó là lý do gây ra hiện tượng tăng áp trên hệ thống của bạn.

Nếu sau khi đảo đầu cột mà áp suất vẫn cao. Điều này chứng tỏ cột của bạn đã bị nhiễm bẩn (do tủa của mẫu hoặc pha động bên trong cột, do các hợp chất hấp thụ quá sâu vào trong cột,…). Chúng ta tiến hành rửa cột với các pha động theo thứ tự tăng dần độ phân cực. Bảng bên dưới liệt kê danh sách các dung môi hữu cơ theo thứ tự tăng dần độ phân cực.

Lưu ý:

• Dùng ít nhất là 25mL của mỗi dung môi để rửa cột.
• Quá trình rửa cột sẽ tốn thời gian khá lâu và bạn nên thực hiện nó trong chế độ offline. Cũng như bạn nên dự trù trước thời gian để sắp xếp công việc của bạn.
• Nếu các bạn tiến hành rửa cột bằng các dung môi có độ phân cực thấp như Hexane hay Methylene Chloride thì chúng ta bắt buộc phải tiếp tục rửa cột qua Isopronanol rồi mới được sử dụng với pha động có độ phân cực cao hơn.

Một số người cho rằng chúng ta nên thay thế màng lọc bên trong của cột để cải thiện tình hình tạp bẩn của cột. Nhưng xin thưa, việc làm đó vô cùng khó khăn cũng như cần phải có đầy đủ thiết bị, dụng cụ để chúng ta mở và thay màng lọc của cột.

Với cấu tạo như vậy thì việc thay thế màng lọc của cột sắc ký lỏng là rất khó. Vì vậy thay vì chúng ta làm việc khó khăn, chúng ta hãy làm những biện pháp phòng ngừa để ngăn chặn việc nghẹt cột xảy ra thì sẽ dễ hơn nhiều.

Mẹo: Kỹ thuật phòng chống hiện tượng nghẹt cột – rẻ mà hữu hiệu:

1. Sử dụng bảo vệ cột: bao gồm hệ thống lọc dây pha động, bộ bảo vệ cột.
2. Lọc mẫu cho mỗi lần phân tích.
3. Lọc pha động cho mỗi lần phân tích.

Đây là những biện pháp dễ dàng, rẻ nhưng vô cùng tiện lợi giúp hạn chế tối đa hiện tượng nghẹt cột trong hệ thống HPLC.

I. Chẻ Peak

Chẻ peak bởi sự phá vỡ các rãnh dẫn mẫu trong cột:

Các bạn hãy tưởng tượng, khi ta tiến hành bơm mẫu cùng pha động vào cột. Các dòng chất lỏng sẽ len lỏi giữa các hạt silica gel và tạo nên các rãnh dẫn truyền mẫu. Sự phá vỡ các rãnh dẫn mẫu trong cột – do 1 lý do khách quan hay chủ quan nào đó – làm cho peak của chúng ta bị chẻ.

Dòng chảy của mẫu trong lòng cột HPLC

Nguyên nhân chính ở đây là do:

• Các rãnh dẫn truyền này bị phá vỡ bởi các bọt khí.
• Do cột có chất lượng không tốt làm cho dòng chảy của mẫu trong cột không ổn định.
• pH của pha động quá cao làm hòa tan silica gel trong cột.

Hình dạng giữa peak bình thường và peak bị chẻ

Với vấn đề này, đôi lúc peak sẽ bị chẻ ngẫu nhiên, cũng có lúc các peak bị chẻ thành peak đôi hết. Vấn đề này cũng thường bị lẫn lộn với việc chẻ peak do đầu lọc pha động bị nghẹt 1 phần. Khi đầu lọc pha động bị nghẹt 1 phần cũng sẽ gây ra hiện tượng như trên.

Vấn đề này rất khó để giải quyết triệt để. Vì nó có nguyên nhân trực tiếp từ chất lượng của cột HPLC, hệ thống đang chạy có bộ degasser hoạt động kém hoặc do tay nghề của kiểm nghiệm viên (khi pha pha động, làm mẫu có bọt khí…).

• Về yếu tố con người: Chúng ta nên kiểm tra lại xem thao tác kiểm nghiệm viên đã đúng chưa, đạt yêu cầu chưa, v.v…
• Về yếu tố thiết bị: Để phòng tránh vấn đề này xảy ra chúng ta nên chọn các loại cột từ các hãng uy tín như: Lachrom của Hitachi, Restek, Tosho,… đồng thời nên có sự lựa chọn đúng đắn loại cột cho từng phép phân tích ví dụ như: khi chạy các dạng pha động có pH cao quá chúng ta nên dùng các loại cột chuyên dụng hoặc nghiên cứu lại pha động để mang lại kết quả tốt nhất.

Đối với vấn đề hệ thống, chúng ta cần liên lạc với sevice để có sự hổ trợ hợp lý, kịp thời. Hoặc nặng hơn là lựa chọn lại dòng sản phẩm HPLC tốt hơn thay thế. Lời khuyên là chúng ta nên sử dụng các hệ thống HPLC có uy tín.

Chẻ peak do cột bị nhiễm bẩn:

Đôi khi, trong quá trình phân tích bạn phải chạy số lượng mẫu quá nhiều và điều đó làm cho cột sắc ký của bạn bị nhiễm bẩn gây nên hiện tượng chẻ peak. Như hiện tượng dưới đây: khi tiến hành chạy tạp trong của APAP trong 1 loại thuốc cảm, người ta thu được phổ đồ như sau:

Với trường hợp chạy quá nhiều mẫu và bị chẻ peak như vậy, chúng ta nên tiến hành kiểm tra các bước sau đây. Thứ nhất là kiểm tra lại bảo vệ cột của chúng ta có bị bẩn hay không, vệ sinh bảo vệ cột. Kế đến nếu hiện tượng vẫn tiếp diễn thì chúng ta nên vệ sinh luôn cột sắc ký của mình (như trình bày ở bài trước).

Chú ý: để hạn chế trường vấn đề này xảy ra, khi các bạn chạy sắc ký quá nhiều mẫu, bạn nên chỉnh thời gian chạy mỗi mẫu dài ra hơn. Hành động này có mục đích là rữa giải cột nhiều hơn trong quá trình chạy mẫu và hạn chế việc cột bị nhiễm bẫn. Ngoài ra chúng ta cũng cần nghiên cứu lại phương pháp xử lý mẫu để giảm thiếu hiện tượng cột bị nhiễm bẩn.

Chẻ peak do hiệu ứng dung môi.

Hiện tượng chẻ peak còn được gặp trong trường hợp sau đây. Khi tiến hành phân tích Salicylamide và Caffein trong 1 loại thuốc giảm đau ta thu nhận được phổ đồ như sau.

Điều kiện phân tích: Pha động: 18% ACN: 82% nước

Peak 1: Caffein; Peak 2: Salicylamide

Khi mà thay đổi dung môi trong mẫu bằng chính pha động thì hiện tượng chẻ peak biến mất.

Điều này chứng tỏ rằng nếu dung môi xử lý mẫu có độ phân cực thấp hơn pha động sẽ gây làm cho peak của mẫu bị bè và chẻ peak. Giải thích cho hiện tượng này, chúng ta hãy hình dung như sau: Khi chúng ta dùng dung môi có độ phân cực thấp hơn, đầu tiên dung môi hiển nhiên có liên kết với hợp chất cần phân tích bên cạnh đó cột sẽ hình thành liên kết giữ dung môi lại (điều tương tự cũng xảy ra với pha động nhưng mà liên kết ở pha động thấp hơn dung môi – do độ phân cực pha động cao hơn dung môi). Điều này làm cho peak của mẫu phân tích bị bè rộng và đôi khi là bị chẻ peak.

Để khắc phục tình trạng này chúng ta nên tiến hành chọn dung môi có độ phân cực cao hơn hoặc bằng pha động (hay nhiều bài báo ghi rằng nồng độ chất hữu cơ ít hơn). Kết quả là chúng ta thu được phổ như hình bên dưới.

Chú ý rằng tùy vào loại cột mà chúng ta nên đọc tài liệu liên quan và tiến hành chọn dung môi thích hợp

III. Peak bị kéo đuôi

Hiện tượng Peak kéo đuôi trong HPLC

Đôi lúc trong quá trình phân tích sắc ký, chúng ta hay gặp các phổ đồ bị kéo đuôi. Có lúc là kéo đuôi 1 vài peak ngẫu nhiên. Đôi lúc là kéo đuôi tất cả các peak. Vậy thì nguyên nhân ở đây là gì và làm cách nào khắc phục hiện tượng đó. Chúng ta hãy cùng nhau tìm hiểu với bài viết sau đây.

Hiện tượng peak kéo đuôi đó là hiện tượng được mô tả trong hình dưới đây.

Đây là hiện tượng kéo đuôi xảy ra ở 1 vài peak ngẫu nhiên.

Đây là hiện tượng kéo đuôi xảy ra với tất cả các peak.

Với mỗi loại kéo đuôi như trên chúng ta có khá nhiều nguyên nhân gây ra. Tiêu biểu là các nguyên nhân sau:

• Đối với vấn đề kéo đuôi ngẫu nhiên vài peak thì nguyên nhân có thể là do cột có chất lượng không ổn định (cột không tốt hoặc cột đã dùng nhiều), hiệu ứng liên kết thứ cấp (liên kết với nhóm silanol có trên cột) hoặc do có 1peak lớn chồng lên 1 peak tạp nhỏ và tạo ra đuôi.
• Đối với vấn đề kéo đuôi tất cả các peak thì ngoài nguyên nhân chất lượng cột, chúng ta còn có thể mắc phải các lỗi sau: lượng mẫu chạy trên cột quá nhiều, có sự hình thành tạp ở đầu cột.

Vậy khắc phục vấn đề này như thế nào? Chúng ta hãy cùng nhau tìm hiểu thế nào là nhóm Silanol và nó ảnh hưởng thế nào mà gây ra hiện tượng peak kéo đuôi.

Nhóm Silanol

Thông thường cột sắc ký pha đảo được cấu tạo từ các hạt silica  như hình sau:

Chính các hạt silica này là tác nhân giúp cho sự phân tách diễn ra trên cột(3). Tuy nhiên trong quá trình sản xuất sẽ vô tình sinh ra các nhóm -OH trên dây carbon của các hạt này. Chính các nhóm này đã làm cho mẫu của chúng ta khi chạy sẽ bị kéo đuôi, giảm độ chọn lọc, độ tin cậy. Có 3 dạng nhóm -OH trên các dây của hạt silica:

Trong 3 dạng silanol này thì dạng Geminal Silanol sẽ có liên kết mạnh nhất và sẽ làm cho peak của chúng ta bị chẻ nhiều hơn. Theo 1 bài báo phân tích (1), người ta đã tiến hành chạy thử pyridine với các cột sắc ký có 3 dạng silanol trên và ta thu được phổ đồ sau.

Chú thích: A-Isolate Silanol; B-Vicinal Silanol; C-Geminal Silanol.

Vì vậy tùy loại Silanol mà có gây ra hiện tượng peak kéo đuôi hay không. Với các công nghệ chế tạo cột hiện nay, các hãng chế tạo cột danh tiếng đã gần như loại bỏ được khá nhiều các dạng silanol này nhằm mang lại kết quả tốt nhất.

Như chúng ta cũng biết hiện tượng kéo đuôi này do hiện tượng dư thừa nhóm Silanol trong cột gây ra. Vì vậy để giải quyết triệt để vấn đề này có lẽ việc lựa chọn cột có chất lượng phù hợp là quan trọng nhất. Khi lựa chọn cột, chúng ta nên chọn cột sắc ký từ những nhà cung cấp danh tiếng như Restek, Tosho,… để có được kết quả tối ưu nhất.

Ngoài ra bằng phương pháp hóa học chúng ta cũng có thể giảm thiểu phần nào hiện tượng peak kéo đuôi. Chúng ta hãy cùng xem xét thí nghiệm sau đây (2): khi phân tích các amine:1 Phenylpropanolamine; 2 Epherine; 3 Amphetamine; 4 Methamphetamine; 5 Phentaramine.

Sử dụng cột Alkyl-C8; 4,6x150mm; 5mL. Pha động: 15% ACN – 85% Na₂HPO₄ 25mM pH 7.0; Tốc độ dòng: 1.0mL/phút.

Thu được phổ đồ như sau:

Rõ ràng chúng ta thấy có sự kéo đuôi đã diễn ra trong phổ đồ trên hình. Vậy thì khi các nhà nghiên cứu thay đổi pH của pha động thì chúng ta thu được kết quả sau đây:

Khi giảm pH của pha động xuống thì hiện tượng kéo đuôi đã được khắc phục thấy rõ. Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm trên cũng cho thấy rằng thời gian lưu sẽ giảm khi giảm pH của pha động xuống tuy nhiên không nhiều lắm.

Trong 1 số nghiên cứu khác chúng ta cũng thu được kết quả tương tự với việc tăng pH của pha động lên. Nhưng cùng với việc tăng pH lên, thời gian lưu của mẫu cũng tăng lên theo và điều nay làm tăng thời gian phân tích mỗi mẫu lên khá nhiều.

Vì vậy, theo tôi để khắc phục triệt để hiện tượng peak kéo đuôi do lực liên kết với nhóm silanol sinh ra chỉ có thể khắc phục triệt để bằng các loại cột chất lượng cao mà thôi. Các biện pháp khác chỉ là tạm thời.

IV. Peak bị nở chân rộng

Peak nở rộng trong HPLC

Trong quá trình phân tích HPLC, ít nhiều chúng ta đã gặp trường hợp peak của chúng ta bị nở rộng ra hai bên. Điều này nếu không được khắc phục hiệu quả sẽ làm cho chúng ta mất rất nhiều thời gian và công sức. Vậy thì chúng ta hãy cùng nhau tìm hiểu nguyên nhân gây ra hiện tượng này là gì và phòng tránh,khắc phục như thế nào.

Dưới đây là hình ảnh của 1 phổ đồ có peak nở rộng:

Peak có thể nở rộng tất cả các peak như hình trên hoặc đôi khi chỉ là 1 vài peak ngẫu nhiên mà thôi. Nguyên nhân chính của hiện tượng này là do: cột của chúng ta đã có tuổi và bị mất hiệu năng, cột bị tắc nghẽn, các mối nối trong hệ thống không tốt, thể tích tiêm mẫu hoặc nồng độ mẫu quá lớn. Ngoài ra khi tiến hành phân tích các mẫu có phân tử khối quá lớn (protein hoặc polymer) cũng gây nên hiện tượng nở rộng peak.

Vậy thì chúng ta khắc phục như thế nào. Nhìn chung chúng ta sẽ có 2 vấn đề chính đó là do phần cứng (cột sắc ký, các mối nối,…) và do phương pháp phân tích.

Với vấn đề do cột sắc ký thì câu trả lời vẫn như các phần trước đó là tiến hành vệ sinh cột. Để phòng tránh hiện tượng này xảy ra, chúng ta luôn lựa chọn cột tốt, bảo quản cột cẩn thận (luôn vệ sinh cột định kỳ, bảo quản đúng cách và dùng các biện pháp bảo vệ cột khỏi nhiểm bẩn).

Với vấn đề về phương pháp phân tích thì chúng ta có thể khắc phục như sau. Nếu phương pháp của chúng ta có thể tích tiêm mẫu quá cao, chúng ta có thể chỉnh lại thông số này để khác phục hiện tượng trên, cũng như mang đến kết quả phân tích tối ưu nhất.

Với thể tích tiêm quá cao sẽ gây ra hiện tượng peak nở rộng.

Còn khi tiến hành phân tích các mẫu có phân tử khối quá lớn như các polymer, protein chúng ta cần xây dựng các phương pháp thích hợp với trang bị phần cứng chuyên dụng. Ví dụ sử dụng các loại cột phân tích chuyên dụng với bộ ổn cột và đầu dò chuyên dụng để mang lại kết quả tốt nhất. Ngoài ra, khi tiến hành phân tích các dạng protein, acid amine chúng ta có thể tiến hành sử dụng các thiết bị chuyên phân tích các chất này.