Kỹ thuật phân lập, tinh chế các hợp chất tự nhiên

Phương pháp tách
Các thành phần trong chiết xuất từ ​​các phương pháp trên rất phức tạp và chứa nhiều loại sản phẩm tự nhiên đòi hỏi phải tách và tinh chế thêm để thu được phần hoạt tính hoặc các sản phẩm tự nhiên nguyên chất. Sự phân tách phụ thuộc vào sự khác biệt vật lý hoặc hóa học của từng sản phẩm tự nhiên. Sắc ký, đặc biệt là sắc ký cột, là phương pháp chính được sử dụng để thu được các sản phẩm tự nhiên nguyên chất từ ​​hỗn hợp phức tạp.
Tách dựa trên tính chất hấp phụ
Sắc ký cột hấp phụ được sử dụng rộng rãi để tách các sản phẩm tự nhiên, đặc biệt là trong giai đoạn tách ban đầu, do tính đơn giản, công suất cao và chi phí thấp của các chất hấp phụ như silica gel và nhựa macropious. Sự phân tách dựa trên sự khác biệt giữa ái lực hấp phụ của các sản phẩm tự nhiên đối với bề mặt của chất hấp phụ. Việc lựa chọn chất hấp phụ (pha tĩnh) cũng như pha động là rất quan trọng để đạt được sự phân tách tốt các sản phẩm tự nhiên, tối đa hóa sự thu hồi các hợp chất mục tiêu và tránh sự hấp phụ không thể đảo ngược của các hợp chất mục tiêu lên các chất hấp phụ.Silica gel là chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi nhất trong điều tra hóa thực vật. Người ta ước tính rằng gần 90% phân tách hóa thực vật (quy mô nhỏ) được dựa trên silica gel. Silica gel là một chất hấp thụ cực với các nhóm silanol. Các phân tử được silica gel giữ lại thông qua các liên kết hydro và tương tác lưỡng cực. Do đó, các sản phẩm tự nhiên phân cực được giữ lại lâu hơn trong các cột silica gel so với các sản phẩm không phân cực. Đôi khi, một số sản phẩm tự nhiên cực có thể trải qua quá trình hóa học không thể đảo ngược. Việc khử silica gel bằng cách thêm nước trước khi sử dụng hoặc sử dụng pha động có chứa nước sẽ làm suy yếu sự hấp phụ. Đuôi nghiêm trọng có thể xảy ra khi tách các ancaloit trên silica gel và việc bổ sung một lượng nhỏ amoniac hoặc các amin hữu cơ như triethylamine có thể làm giảm đuôi. Mười hai alkaloids thuộc nhóm methylchanofrnomosine bao gồm sáu alkaloid mới, prunifolines A khuyên F ( tiếp theo là TLC ly tâm sử dụng các hệ thống hexan hoặc EtOAc / hexane bão hòa amoniac làm dung môi rửa giải.

Alumina (oxit nhôm) là một chất hấp phụ phân cực mạnh được sử dụng trong việc tách các sản phẩm tự nhiên, đặc biệt là trong việc tách các alcaloid. Trường dương tính mạnh của Al3 + và các vị trí cơ bản trong alumina ảnh hưởng đến các hợp chất phân cực dễ dẫn đến sự hấp phụ trên alumina khác với trên silica gel. Việc áp dụng alumina trong việc tách các sản phẩm tự nhiên đã giảm đáng kể trong những năm gần đây vì nó có thể xúc tác mất nước, phân hủy hoặc đồng phân hóa trong quá trình tách. Zhang và Su đã báo cáo một giao thức sắc ký sử dụng alumina cơ bản để tách taxol từ chiết xuất văn hóa Taxus cuspidate callus và nhận thấy sự phục hồi của taxol là hơn 160%. Họ phát hiện ra rằng sự gia tăng của taxol đến từ sự đồng phân hóa 7-epi-taxol được xúc tác bởi alumina. Người ta cũng phát hiện ra rằng một lượng nhỏ taxol có thể bị phân hủy thành baccatin III và 10-deacetylbaccatin III trong cột alumina. Nghiên cứu sâu hơn về việc tách taxol trên alumina có tính axit, trung tính và cơ bản chỉ ra rằng Lewis souci và các lõi hoạt động cơ bản trên bề mặt alumina đã tạo ra sự đồng phân hóa 7-epi-taxol thành taxol.

Các cấu trúc của polyamit được sử dụng trong sắc ký có chứa cả nhóm acryl và amide. Tương tác kỵ nước và / hoặc liên kết hydro sẽ xảy ra trong sắc ký cột polyamide tùy thuộc vào thành phần của pha động. Khi các dung môi phân cực như dung môi nước được sử dụng làm pha động, polyamit đóng vai trò là pha tĩnh không phân cực và hành vi sắc ký tương tự như sắc ký pha đảo. Ngược lại, các polyamit đóng vai trò là pha tĩnh phân cực và hành vi sắc ký tương tự như sắc ký pha thông thường. Sắc ký cột polyamide là một công cụ thông thường để tách các polyphenol tự nhiên bao gồm anthraquinone, axit phenolic và flavonoid, có cơ chế được gán cho sự hình thành liên kết hydro giữa các chất hấp thụ polyamide, pha động và các hợp chất đích. Gao et al. đã nghiên cứu hành vi sắc ký của polyphenol bao gồm axit phenolic và flavonoid trên cột polyamide. Người ta nhận thấy rằng polyamide có chức năng chấp nhận liên kết hydro và số lượng hydroxyl phenolic và vị trí của chúng trong phân tử ảnh hưởng đến cường độ hấp phụ. Ngoài polyphenol, việc tách các loại sản phẩm tự nhiên khác bằng sắc ký cột polyamide cũng được báo cáo. Tổng số saponin của Ku Khánhcha có thể được làm giàu bằng sắc ký cột polyamide, giúp giảm đáng kể áp suất tâm thu của chuột SHR. Sử dụng hỗn hợp dichloromethane và metanol theo độ dốc làm chất rửa giải, bảy ancaloit isoquinoline chính trong Coptidis Rhizoma bao gồm berberine, coptisine, palmatine, jatrorrhizine, colat và Magnoflorine được tách ra trong sắc ký cột polyamide một bước.

Nhựa macropious hấp phụ là chất hấp phụ polymer có cấu trúc vĩ mô nhưng không có nhóm trao đổi ion có thể hấp phụ chọn lọc hầu hết mọi loại sản phẩm tự nhiên. Chúng đã được sử dụng rộng rãi như một hệ thống độc lập hoặc là một phần của quá trình tiền xử lý để loại bỏ tạp chất hoặc làm giàu các hợp chất mục tiêu do các ưu điểm của chúng, bao gồm khả năng hấp phụ cao, chi phí tương đối thấp, tái sinh dễ dàng và mở rộng quy mô dễ dàng. Các cơ chế hấp phụ của nhựa macropious hấp phụ bao gồm lực tĩnh điện, liên kết hydro, sự hình thành phức tạp và kích thước sàng lọc giữa các loại nhựa và các sản phẩm tự nhiên trong dung dịch. Diện tích bề mặt, đường kính lỗ rỗng và độ phân cực là những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất của nhựa. (S) -protopanaxatriol saponin (PTS) và (S) -protopanaxadiol saponin (PDS) được gọi là hai thành phần hoạt tính sinh học chính trong rễ của Panax notoginseng. PTS và PDS đã được phân tách thành công với dung dịch ethanol 30 và 80% (v / v) từ cột nhựa macropious D101, tương ứng. Các hoạt động sắc ký của PDS và PTS gần với sắc ký pha đảo khi so sánh các cấu hình sắc ký của sắc ký cột nhựa macropious với sắc ký HPLC trên cột Zorbax SB-C18. Gần đây, Mạnh và cộng sự thu được tổng số saponin của Panacis Japonici Rhizoma (PJRS) bằng nhựa macropious D101. Nội dung của bốn saponin chính, chikusetsusaponin V, IV và IVa, và pseudoginsenoside RT1, trong PJRS thu được là hơn 73%. Các PJRS đóng vai trò là tài liệu tham khảo tiêu chuẩn để kiểm soát chất lượng của Panacis Japonici Rhizom. Một số nhà nghiên cứu cho rằng cơ chế hấp phụ chính giữa nhựa đa lượng và polyphenol có liên quan đến sự hình thành liên kết hydro giữa nguyên tử oxy của liên kết ether của nhựa và nguyên tử hydro của nhóm phenol hydroxyl của phenol. Các bon hydro của nhóm phenol hydroxyl của phenol. Lực tương tác liên kết hydro bị ảnh hưởng đáng kể bởi giá trị pH của dung dịch.

Bạc nitrat là một hỗ trợ vững chắc hữu ích khác trong việc tách các sản phẩm tự nhiên. Những sản phẩm tự nhiên chứa các electron π tương tác thuận nghịch với các ion bạc để tạo thành các phức cực. Số lượng liên kết đôi hoặc độ thơm của sản phẩm tự nhiên càng nhiều thì các dạng phức tạp càng mạnh. Bạc nitrat thường được ngâm tẩm trên silica gel (SNIS) hoặc alumina để tách. Một số nhóm nghiên cứu đã báo cáo việc tách axit béo trên SNIS. Wang và cộng sự. báo cáo phân lập zingiberene từ oleoresin gừng bằng sắc ký cột SNIS. Một cặp đồng phân, axit brasiliensic và axit isobrasiliensic, được tách ra từ Calophyllum brasiliense bởi Lemos et al. trên cột SNIS. Một số nhóm nghiên cứu cũng áp dụng bạc nitrat trong hệ thống hai pha trong sắc ký ngược dòng tốc độ cao (HSCCC) để cải thiện sự phân tách. Xanthochymol và guttiferone E là một cặp đồng phân benzophenone liên kết π từ Garcinia xanthochymus bởi AgNO3-HSCCC. Thứ tự rửa giải của các đồng phân liên kết π trong phân tách AgNO3-HSCCC này là liên kết π bên trong (trước đó), giống hệt với kết quả quan sát được từ sắc ký cột SNIS.

Tách dựa trên hệ số phân đoạn

Sắc ký phân đoạn (PC) tuân theo nguyên tắc chiết chất lỏng dựa trên độ hòa tan tương đối trong hai chất lỏng bất biến khác nhau. Ở giai đoạn đầu, một pha lỏng được tráng thành một ma trận rắn (silica gel, carbon, cellulose, v.v.) khi pha tĩnh và pha lỏng khác được sử dụng làm pha động. Nhược điểm của giai đoạn đứng yên dễ dàng loại bỏ và kết quả không thể lặp lại đã dẫn đến loại PC này hiếm khi được sử dụng ngày nay. Pha ngoại quan, trong đó pha tĩnh lỏng liên kết hóa học với hỗ trợ trơ, được sử dụng làm pha tĩnh khắc phục những nhược điểm đó. Các loại alkyl có bán trên thị trường như C8 và C18, aryl, cyano và amino thay thế thường được sử dụng làm pha ngoại quan, được sử dụng rộng rãi để tách nhiều loại sản phẩm tự nhiên, đặc biệt là trong bước tinh chế cuối cùng.
Ba PTS (notoginsenoside R1, ginsenosides Rg1 và Re và hai PDS [ginsenosides Rb1 và Rd] được phân tách tốt trong cột C18 bằng cách sử dụng hệ thống EtOHTHER H2O làm pha động. Một giai đoạn cố định silica dựa trên polyacrylamide mới được tổng hợp bởi Cai et al. và đã được áp dụng thành công trong việc tách galactooligosacarit và saponin của Paris polyphylla với EtOHlahoma H2O là pha động.

Sắc ký ngược dòng (CCC) là loại PC giữ pha tĩnh ở trạng thái lỏng bằng trọng lực hoặc lực ly tâm. CCC hiếm khi được sử dụng trong giai đoạn đầu do khả năng duy trì ổn định kém, thời gian tách dài và quá trình sử dụng nhiều lao động. CCC đã được cải thiện đáng kể trong những năm 1980, tuy nhiên, khi CCC hiện đại, bao gồm HSCCC và sắc ký phân vùng ly tâm (CPC), được phát triển. Các hệ thống CCC thủy động lực như HSCCC có chuyển động quay hành tinh xung quanh hai trục quay không có vòng đệm xoay, cung cấp quá trình giảm áp suất thấp. CCC thủy tĩnh, ví dụ, sắc ký phân vùng ly tâm, chỉ sử dụng một trục quay và có một loạt các buồng liên kết để bẫy pha tĩnh, cung cấp khả năng lưu giữ pha tĩnh cao hơn và áp suất hệ thống cao hơn HSCCC. Áp suất hệ thống cao trong CPC ngăn cản việc cải thiện độ phân giải bằng cách tăng độ dài của cột. CCC hiệu suất cao (HPCCC) đại diện cho một thế hệ CCC thủy động lực mới và hoạt động theo cách tương tự như HSCCC, nhưng với mức g cao hơn nhiều. Các thiết bị HPCCC tạo ra hơn 240 g, trong khi thiết bị HSCCC ban đầu cho mức g dưới 80 g. HPCCC rút ngắn thời gian tách xuống dưới một giờ so với vài giờ trong HSCCC trước đó và có thể đạt được ít nhất mười lần thông lượng của một công cụ HSCCC. So với phương pháp tách cột thông thường sử dụng pha tĩnh, cả hệ thống CCC thủy tĩnh và thủy động lực đều cung cấp một số ưu điểm bao gồm loại bỏ hấp phụ không thể đảo ngược và điều chỉnh đỉnh, khả năng tải cao, thu hồi mẫu cao, ít rủi ro biến tính mẫu và tiêu thụ dung môi thấp. Hạn chế của CCC là nó chỉ tách các hợp chất trong một cửa sổ phân cực tương đối hẹp. Trong 20 năm qua, HSCCC, HPCCC và CPC đã thu hút sự chú ý lớn trong khoa học phân tách và đã được sử dụng rộng rãi trong việc tách các sản phẩm tự nhiên. Tang et al. đã phát triển một phương pháp HSCCC sử dụng hệ thống dung môi hai pha bao gồm ethyl acetate, n-butanol, nước ethanol ethanol (4: 2: 1.5: 8.5, v / v / v / v) để tách sáu flavone C-glycoside, bao gồm hai hợp chất mới từ Lophatherum gracile. HSCCC, HPCCC và CPC cũng đã được áp dụng thành công trong việc tách dầu dễ bay hơi, rất khó tách qua sắc ký cột thông thường. Sáu hợp chất dễ bay hơi (curdione, curcumol, mamacrone, curzerene, 1,8-cineole đã được phân lập bởi CPC từ tinh dầu Curcuma wenyujin sử dụng hệ thống dung môi hai pha không màu bao gồm dầu hỏa ether acet acetonitrile, acetone (4: 3: 1 v / v / v). Bốn loại Sesquiterpenoids chính (ar-turmerone, α-turmerone,-turmerone và E-atlantone) với các cấu trúc tương tự đã được tách ra khỏi tinh dầu Curcuma longa trong một lần chạy HSCCC duy nhất sử dụng hệ dung môi hai pha gồm n-heptane, ethyl acetate, acetonitrile, nước (9,5 / 0,5 / 9/1, v / v) và mỗi hợp chất đạt độ tinh khiết hơn 98%. Linalool, terpinen-4-ol, α-terpineol, p-anisaldehyd, anethole và foeniculin đã được phân lập thành công từ tinh dầu Pimpinella anisum bằng HPCCC một rửa giải gradient từng bước. Li et al. đã phát triển một phương pháp CPC để tách rượu patchouli với hệ thống dung môi ether không acetonitrile (1: 1, v / v) không màu. Hơn 2 g rượu hoắc hương với độ tinh khiết hơn 98% được phân lập từ 12,5 g tinh dầu trên cột 240 ml. Cột thể tích lớn (vài lít) đã được sử dụng trong CCC thủy tĩnh thương mại và thiết bị CCC thủy động lực để phân tách quy mô thí điểm / công nghiệp. Một số báo cáo có thể thu được do bảo mật thương mại. Thật khó để đánh giá liệu CCC thủy tĩnh hay thủy động lực tốt hơn cho các ứng dụng công nghiệp. Người dùng có thể chọn các loại công cụ CCC khác nhau cho các mục đích khác nhau. Khi pha tĩnh được giữ lại kém trong CCC thủy động lực do độ nhớt cao và chênh lệch mật độ nhỏ giữa pha động và pha tĩnh, CCC thủy tĩnh thực tế hơn CCC thủy động lực vì độ lưu của pha tĩnh của CCC thủy tĩnh ít nhạy hơn với pha tĩnh tính chất của hệ thống chất lỏng và sẽ có độ lưu giữ cao hơn của pha tĩnh. Khi pha tĩnh được giữ lại tốt trong CCC thủy động lực, hiệu quả tách cao hơn sẽ thu được từ CCC thủy động lực so với CCC thủy tĩnh với cùng hệ thống chất lỏng và thể tích cột tương tự vì CCC thủy tĩnh có hiệu quả phân vùng tương đối thấp do mức độ trộn hạn chế và hệ thống thủy động lực cung cấp sự pha trộn hiệu quả để mang lại hiệu quả phân vùng cao.

Tách dựa trên kích thước phân tử
Việc tách các sản phẩm tự nhiên bằng phương pháp lọc màng (MF) hoặc sắc ký lọc gel (GFC) dựa trên kích thước phân tử của chúng.
Màng lọc (MF)
Trong MF, màng bán kết cho phép các phân tử nhỏ hơn đi qua và giữ lại các phân tử lớn hơn. MF của các sản phẩm tự nhiên có thể được đặc trưng là vi lọc, siêu lọc và lọc nano dựa trên kích thước lỗ rỗng của màng được áp dụng. Màng lọc là một công cụ mạnh mẽ để cô đặc, làm rõ và loại bỏ các tạp chất trong phòng thí nghiệm, cũng như trong các ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Nội dung của tổng phenol (338%), axit chlorogen (483%), theobromine) (323%), caffeine (251%), tannin cô đặc ( 278%) và saponin (211%) trong dịch chiết của Ilex paraguariensis được tăng đáng kể bằng phương pháp lọc nano. Ghép màng lọc được áp dụng khi một bước lọc màng đơn không đạt yêu cầu. Một chuỗi các vi lọc, siêu lọc và lọc nano đã được áp dụng trong việc phân lập các thành phần hoạt tính sinh học từ chiết xuất lá ô liu. Quá trình vi lọc tiếp theo là siêu lọc loại bỏ các tạp chất lớn hơn 5 kDa. Nanofiltration đã phục hồi các polyphenol chống oxy hóa và kháng khuẩn và flavonoid, và hàm lượng của thành phần chính, oleuropein, trong retentate lọc nano được tập trung khoảng mười lần.

Sắc ký lọc gel (GFC)
Sắc ký lọc gel còn được gọi là sắc ký thẩm thấu gel hoặc sắc ký loại trừ kích thước. Các phân tử nhỏ có thời gian lưu trong GFC lâu hơn các phân tử lớn.
Sephadex được hình thành bởi dextran liên kết ngang, và loại G của Sephadex được sử dụng để tách các hợp chất ưa nước như peptide, oligosacarit và polysacarit.
Sephadex LH20, một dẫn xuất hydroxypropyl hóa của Sephadex G25, có cả bản chất kỵ nước và ưa nước. Một cơ chế hấp phụ cũng tham gia vào quá trình phân tách bằng Sephadex LH-20. Sephadex LH-20 có thể được sử dụng để tách nhiều loại sản phẩm tự nhiên trong hệ thống dung môi nước hoặc không dung dịch nước. Các oligosacarit feruloylated arabinoxylan của lúa mì trung gian ngũ cốc lâu năm được phân tách tốt bằng Sephadex LH-20 sử dụng 100% nước làm pha động. Ba pyrimidine diterpenes mới, axistatins 1 cùng với ba formamide đã biết được phân lập từ phần CH2Cl2 hoạt tính chống ung thư của Agelas axifera trên cột Sephadex LH-20 của CH₃OH, CH₃OH–CH₂Cl₂ (3:2), hexane–CH₃OH–2-propanol (8:1:1), hexane–toluene–CH₂Cl₂–EtOH (17:1:1:1) và exane–EtOAc–CH₃OH (4:5:1)], tiếp theo là tinh chế bằng Prep-HPLC .

Tách dựa trên cường độ ion
Sắc ký trao đổi ion (IEC) phân tách các phân tử dựa trên sự khác biệt về điện tích bề mặt ròng của chúng. Một số sản phẩm tự nhiên, chẳng hạn như alkaloids và axit hữu cơ sở hữu một nhóm chức có khả năng ion hóa, có thể được phân tách bằng IEC. Các phân tử tích điện có thể được bắt và giải phóng bằng nhựa trao đổi ion bằng cách thay đổi cường độ ion của pha động (ví dụ: thay đổi nồng độ pH hoặc muối). Nhựa trao đổi ion cation được sử dụng để tách các ancaloit, trong khi nhựa trao đổi ion anion được sử dụng để tách axit hữu cơ tự nhiên và phenol.
Các anthocyanin tích điện dương được tách ra khỏi các hợp chất polyphenolic trung tính trong chiết xuất trái cây Actinidia melanandra (quả kiwi) được xử lý bằng nhựa trao đổi ion cation Dowex 50WX8. Feng và Zhao đã sử dụng sắc ký bán chuẩn bị để tách (-) epigallocatechin-gallate và (-) epicatechin-gallate trong chiết xuất thô trà với gel axit yếu dựa trên polysacarit CM-Sephadex C- 25. Một loại alkaloid mới, fumonisin B6, cùng với một loại alkaloid đã biết, fumonisin B2, đã được phân lập bởi IEC trên nhựa trao đổi RP-cation chế độ hỗn hợp Strata XC, sau đó là sắc ký pha ngược từ nấm Aspergillus niger.

Trợ giúp nghiên cứu của chuyên gia

Trên đây là các phương pháp tách chất hiện đại đang được sử dụng tại các phòng thí nghiệm hiện đại trên thế giới như Hàn Quốc, Nhật Bản, Việt Nam. Đội ngũ quản trị viên của chúng tôi có rất nhiều kinh nghiệm về chiết xuất, tách chất, phân tích, xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất. Chúng Tôi luôn sẵn sàng trợ giúp các bạn về các kỹ thuật tách chất, xác định cấu trúc, phân tích các hợp chất tự nhiên và công bố trên tạp chí uy tín quốc tế (thuộc danh mục SCI, SCIE, Q1, Q2, Q3 hoặc tạp chí quốc tế). Mặt khác, chúng tôi sẽ giúp đỡ các nghiên cứu viên trong lựa chọn đối tượng nghiên cứu, hoàn thành các dự án nghiên cứu đảm bảo chất lượng cao cho các đề tài các cấp cũng như đào tạo tiến sĩ, thạc sĩ, khóa luận tốt nghiệp.