Phương pháp sử dụng cột amin

Khi sử dụng cột amino ((NH2) trong một khoảng thời gian, bạn có gặp phải hiện tượng giảm hiệu suất cột và tăng áp suất cột？ Hoặc các đỉnh nhiễu bất thường và thời gian lưu trôi đi không? Hoặc không thể tái tạo phương pháp trong một số sắc ký nhất định hoặc độ phân giải, tấm và hệ số đuôi không thể đáp ứng yêu cầu phát hiện? Sự độc đáo của cột NH2 đã gây ra cho chúng ta rất nhiều rắc rối, vì vậy hôm nay chúng ta sẽ thảo luận về cột NH2.

Nhóm chức liên kết của cột NH2 là aminopropyl dễ bị thủy phân hơn C18, C8 và C4 thông thường. Vì vậy, trước khi sử dụng cột NH2, chúng ta phải chuẩn bị tâm lý rằng tuổi thọ của cột NH2 ngắn hơn rất nhiều so với cột thông thường.

Cột NH2 có thể được sử dụng như pha bình thường hoặc pha đảo. Vì dung môi được sử dụng trong hai pha là không thể trộn lẫn, vì vậy cần có sự chuyển tiếp với isopropanol để chuyển đổi giữa pha bình thường và pha đảo. Việc sử dụng và duy trì cột NH2 trong pha đảo và pha bình thường sẽ được thảo luận tương ứng dưới đây.

Pha đảo

Nếu pha động không chứa bất kỳ axit, kiềm hoặc muối nào, cột NH2 phải được rửa sạch và bảo quản bằng axetonitril 100% sau khi thử mẫu. Nếu pha động chứa axit, kiềm hoặc muối, trước hết rửa cột bằng 60% axetonitril trong 40 phút, sau đó rửa sạch và bảo quản bằng 100% axetonitril.

Khi sử dụng ở pha đảo, hãy chú ý đến phạm vi pH của pha động. PH càng thấp thì quá trình thủy phân càng dễ dàng. Phạm vi pH lý tưởng là 3-7. Ngoài ra, tỷ lệ nước trong pha động càng cao thì quá trình thủy phân càng dễ dàng.

Ps

Sau khi sử dụng, nên xả và bảo quản cột trong pha hữu cơ nguyên chất để đạt hiệu quả bảo quản tốt và kéo dài tuổi thọ. Ngoài ra, nếu cột có trường hợp áp suất cao bất thường, hình dạng đỉnh bất thường, hiệu suất cột thấp hoặc độ phân giải thấp, trước hết sử dụng pha động chuyển tiếp để rửa sạch muối, sau đó rửa sạch như sau: 100% axetonitril → 100% metanol → 100% isopropanol → 100% acetonitril ở tốc độ dòng phân tích trong 30 phút mỗi bước, trong khi isopropanol cần tốc độ dòng thấp hơn do độ nhớt cao.

Pha bình thường

Cột phải được rửa bằng 100% n-hexan và được bảo quản bằng n-hexan / isopropanol (90/10).

Trong chế độ pha thường, hàm lượng nước của pha tĩnh là một thông số chính ảnh hưởng đến tính chọn lọc, trong khi hàm lượng nước của pha động ảnh hưởng đến thời gian lưu và độ phân giải, do đó thời gian lưu có thể dễ dàng thay đổi khi hàm lượng nước giữa pha tĩnh và thay đổi pha động. Nên loại bỏ nước khỏi cột amin.

Gợi ý:

1. Loại bỏ nước khỏi pha tĩnh:

Rửa cột bằng 30 thể tích cột n-hexan chứa 2,5% dimetoxy propan và 2,5% axit axetic băng.

2. Sử dụng pha động với hàm lượng nước được kiểm soát

Phương pháp pha động nửa bão hòa: chia đôi pha động không phân cực khan. Thêm một lượng nước nhất định vào một nửa, sau đó trộn và khuấy trong khoảng 1 giờ. Sau khi phân tầng tĩnh, loại bỏ pha nước thừa, trộn hai nửa với nhau để tạo thành pha động “nửa bão hòa”.

Ps

Nếu cột có các trường hợp bất thường về áp suất cao, hình dạng đỉnh bất thường, hiệu suất cột thấp hoặc độ phân giải thấp, rửa sạch cột như sau: 100% isopropanol → 100% metanol → 100% isopropanol ở tốc độ dòng phân tích trong 40 phút mỗi bước, còn isopropanol cần tốc độ dòng chảy thấp hơn do độ nhớt cao.

Cột đặc biệt cho Lactose

Một cột amin đặc biệt cũng được giới thiệu bởi Welch – Xtim® Lactose-NH2. Nên sử dụng 100% acetonitril để rửa và bảo quản. Nếu xuất hiện các trường hợp bất thường về áp suất cao, hình dạng đỉnh bất thường, hiệu suất cột thấp hoặc độ phân giải thấp, rửa cột bằng 100% metanol → 100% axetonitril → 100% isopropanol → 100% axetonitril trong 3 giờ mỗi bước.

Nếu có những bất thường như tăng nhiễu, tăng trôi, độ phân giải không đủ hoặc không đủ tấm, cần lưu ý những điểm sau:

1. Trộn pha động và lắc đều, sử dụng bộ lọc chân không và khử khí bằng sóng siêu âm trong 10 phút, sử dụng một kênh và không sử dụng bộ lọc nội tuyến.

2. Thể tích thuốc tiêm cần phải đúng theo yêu cầu của Dược điển. Tốt hơn nên sử dụng vòng lặp 10 μL nếu thể tích tiêm là 10 uL để giảm ảnh hưởng của thể tích chết bên ngoài cột. Các sắc ký đồ dưới đây là sự so sánh giữa thể tích tiêm 20 μL (hình ảnh bên trái) và thể tích tiêm 10 μL (hình ảnh bên phải).

3. Bởi vì RID nhạy cảm với nhiệt độ, khuyến nghị nên lấp đầy tủ sấy bằng khăn hoặc bông khô để hoạt động như một phương tiện truyền nhiệt cho hiệu ứng sắc ký và đường nền ổn định.

Thực tế là thời gian tồn tại của cột NH2 ngắn hơn so với các cột thông thường do sự phân cực đặc biệt của các nhóm chức amin. Hy vọng những phương pháp trên sẽ giúp kéo dài tuổi thọ của cột NH2 rất nhiều.