Bài viết ngành dược, Bài viết về sản xuất thuốc
Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời puerarrin, daidzin và daidzein trong rễ củ Sắn dây trên hệ thống máy HPLC-PDA
Tóm tắt
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép với detector PDA được xây dựng cho định lượng đồng thời puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) trong rễ củ sắn dây. Điều kiện chiết xuất tối ưu là dung môi ethanol 35%, siêu âm trong một giờ. Các đường chuẩn trong khoảng nồng độ định lượng, chúng có hệ số tuyến tính cao (R2 > 0,999). Độ chính xác của phương pháp phân tích trong ngày và các ngày tiếp theo có RSD đều không quá 3,7% và 4,08%. Kết quả nghiên cứu cho thấy, phương pháp định lượng đồng thời các isoflavonoid trong rễ củ sắn dây có thời gian phân tích nhanh, chính xác và đơn giản.
Từ khóa: Pueraria, Puerarin, Daidzein, Daidzin, HPLC-PDA.
Summary
Development of an HPLC-PDA Method for Simultaneous Determination of Puerarin, Daidzin and Daidzein in Puerariae Radix
An high-performance liquid chromatography coupled with diode array detection method was developed for the simultaneous quantification of puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) in Puerariae Radix. As a result, the optimized extraction solvent was 35% ethanol with an ultrasonication extraction in one hour. All calibration curves showed good linearity (R2 > 0.999) within the test ranges. The intra-day and inter-day variations were less than 3.7% and 4.08%, respectively. The current study has proposed a rapid, accurate and simple HPLC method which allows the simultaneous determination of three isoflavones in Puerariae Radix.
Keywords: Pueraria, Puerarin, Daidzein, Daidzin, HPLC-PDA.
1. Đặt vấn đề
Trong y học cổ truyền vị thuốc cát căn (rễ củ sắn dây) được sử dụng làm thuốc chữa sốt, cứng gáy, khát, sởi chưa mọc, lỵ và tiêu chảy [1]. Theo Dược điển Trung Quốc, sắn dây (Kudzu) có hai chuyên luận khác nhau về hai thứ của loài Pueraria montana là P. thomsonii (P. montana var. thomsonii) và P. lobata (P. montana var. lobata) [2]. Chuyên luận sắn dây trong Dược điển Việt Nam V là rễ củ của P. thomsonii Benth. [1]. Thành phần hóa học trong rễ củ sắn dây chứa các nhóm như isoflavonoid, flavon, triterpenoid glycosid và tinh dầu [3]. Các thành phần isoflavonoid trong sắn dây như puerarin, daidzin, daidzein đã được chứng minh có các tác dụng bảo vệ gan, điều trị bệnh tim mạch, tăng huyết áp, đái tháo đường, giảm độc ethanol [4]. Các nghiên cứu cho thấy daidzein, genistein có tác dụng ức chế cạnh tranh với γ2-γ2-ADH-isoenzym với ethanol và ức chế không cạnh tranh với γ2-γ2-ADH isoenzym NAD+ [3]. Các isoflavonoid của sắn dây còn được chứng minh có tác dụng giảm hấp thu rượu từ đường uống, giảm rõ rệt các triệu chứng gây ra do rượu trên động vật thí nghiệm. Dược điển Trung Quốc quy định hàm lượng puerarin trong taxon P. lobata từ 2,4% và P. thomsonii 0,3% trở lên [2]. Dược điển Việt Nam V, chỉ định tính puerarin dựa trên phương pháp sắc ký lớp mỏng [1]. Do đó, xây dựng phương pháp định lượng đồng thời puerarin, daidzin và daidzein trong rễ củ sắn dây trên hệ thống máy HPLC-PDA sẽ có vai trò quan trọng góp phần kiểm soát chất lượng của dược liệu cát căn lưu hành trên thị trường Việt Nam.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng, nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
Đối tượng: Mẫu rễ củ phơi sấy khô của cây sắn dây (Pueraria thomsonii Benth.) (SD1) thu hái tại Vườn Thực vật – Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ, tháng 12 năm 2017. Mẫu tiêu bản (CDYDPT/TV/SD01/2017) được xác định bởi TS. Phạm Quốc Tuấn, lưu tại Phòng lưu mẫu, Bộ môn Dược liệu – Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ.
Hóa chất: Các dung môi sử dụng gồm: methanol (MeOH), acetonitril (MeCN), acid formic, ethanol (EtOH) 96%, nước cất. Chất chuẩn đối chiếu gồm puerarin (1), daidzin (2) và daidzein (3) có độ tinh khiết ≥ 98% theo HPLC được mua từ hãng Sigma-Aldrich.
Thiết bị HPLC: Máy HPLC CBM-20A (Shimadzu Corporation, Kyoto, Nhật) ghép với detector Diode Array SPD-M20A, cột SupelcosilTM (250 mm × 4,6 mm, 5 μm).
2.2. Phương pháp nghiên cứu
– Tối ưu hóa điều kiện sắc ký: Dựa trên khảo sát độ hấp thụ UV của chất phân tích, hệ dung môi pha động, nồng độ acid formic, tốc độ dòng cho chương trình sắc ký.
– Tối ưu hóa điều kiện chiết xuất: Khảo sát hệ dung môi chiết gồm các hỗn hợp EtOH-H2O; MeOH-H2O, phương pháp chiết và thời gian chiết.
– Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Các dung dịch chất chuẩn gốc 1, 2, 3 nồng độ 1000 µg/mL được pha trong EtOH 35%, từ dung dịch trên pha loãng thành các dung dịch có nồng độ phù hợp. Dung dịch chất chuẩn được đựng trong lọ thủy tinh, đóng kín, dán màng seal, bảo quản ở 4ºC trong tủ lạnh. Đường chuẩn được xây dựng dựa trên tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích 1, 2 và 3.
– Thẩm định phương pháp phân tích:
Phương pháp phân tích được thẩm định theo yêu cầu chung của ICH (International Conference on Harmonisation) gồm các yêu cầu sau: tính tương thích của hệ thống, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác, độ đúng [5].
2.3. Áp dụng phương pháp thẩm định được vào các mẫu thu hái trên địa bàn
2.4. Xử lý số liệu phân tích
Các thí nghiệm được thực hiện ba lần, kết quả lấy giá trị trung bình (). Các số liệu thống kê được tính trên phần mềm GraphPad Prism 7.
3. Kết quả và Bàn luận
3.1. Tối ưu các điều kiện sắc ký
Dựa trên phổ hấp thụ UV, các chất đối chiếu 1, 2, 3 có cực đại hấp thụ tại bước sóng lần lượt là 254, 250 và 258 nm. Do đó, bước sóng 254 nm được lựa chọn cho định lượng các mẫu phân tích 1, 2 và 3. Các hệ dung môi pha động MeCN-H2O và MeOH-H2O được khảo sát khả năng tách trên hệ thống HPLC. Kết quả cho thấy, hệ dung môi MeOH-H2O tách tốt hơn, giá thành rẻ hơn nên được lựa chọn. Cuối cùng, pha động MeOH-H2O chứa 0,05% acid formic theo chương trình gradient (0 – 20 phút: 27% A; 20 – 25 phút: 27% – 50% A), kết quả sắc ký đồ cho thấy các chất phân tích tách khỏi nhau hoàn toàn, thời gian ngắn, không có pic nào chồng lấp được sử dụng cho phương pháp định lượng. Các chất đối chiếu được xác định trong mẫu dựa theo thời gian lưu, phổ hấp thụ UV và xác nhận bởi thêm chất chuẩn vào mẫu cho từng chất. Điều kiện tối ưu gồm có: detector UV đo tại bước sóng 254 nm. Hệ dung môi pha động MeOH (A) và H2O chứa 0,05% acid formic (B) chạy theo chương trình gradient (0 – 20 phút: 27% A; 20 – 25 phút: 27% – 50% A), thể tích tiêm mẫu 10 µL, tốc độ dòng 1 mL/phút.
3.2. Tối ưu điều kiện chiết xuất
Mẫu sắn dây (hàm ẩm 8,7%) được xay mịn rây qua rây 200 µm đảm bảo đồng nhất. Cân 0,3 g bột trên, thêm 50 mL dung môi chiết xuất được thí nghiệm như sau: dung môi gồm 95%, 75%, 50%, 25% EtOH và 100%, 75%, 50%, 25%, 0% MeOH, sau đó được siêu âm 30 phút. Kết quả cho thấy khoảng nồng độ 25% – 50% EtOH có hiệu suất chiết cao nhất. Tiếp tục chiết mẫu trong EtOH ở các nồng độ 25, 30, 35, 40, 45, 50%, trên sắc ký đồ tại nồng độ 35% cho diện tích pic lớn nhất, nên được chọn làm dung môi chiết xuất.
Khảo sát phương pháp chiết bằng siêu âm so sánh với chiết nóng hồi lưu của mẫu trong thời gian 30 phút, kết quả diện tích pic của các chất chuẩn khác nhau không đáng kể. Phương pháp siêu âm được lựa chọn để chiết mẫu. Tiếp tục khảo sát thời gian chiết tại 30 phút, 45 phút, 60 phút, 75 phút. Tại thời điểm 60 phút khi siêu âm, diện tích pic của chúng không tăng, do đó thời gian trên phù hợp để chiết xuất.
3.3. Thẩm định phương pháp
3.3.1. Tính tương thích của hệ thống, chọn lọc, đặc hiệu
Hỗn hợp các mẫu chuẩn 1, 2, 3 ở nồng độ 100 µg/mL được phân tích 5 lần liên tiếp với chạy sắc ký 5 lần, kết quả cho thấy diện tích pic của 3 chất chuẩn thay đổi không đáng kể, nên hệ thống phù hợp để phân tích 1, 2 và 3.
Bảng 1. Kết quả khảo sát tính tương thích
của hệ thống của 1, 2 và 3
| Chất phân tích | Thời gian lưu (phút) | Diện tích pic | ||
| tR | RSD (%) | S | RSD (%) | |
| 1 | 5,85 ± 0,03 | 0,51% | 4838431 ± 34179 | 0,7% |
| 2 | 7,68 ± 0,01 | 0,13% | 2994198 ± 10286 | 0,34% |
| 3 | 13, 92 ± 0,04 | 0,28% | 2939041 ± 20177 | 0,68% |
Các kết quả về thời gian lưu và diện tích pic của các chất chuẩn 1, 2, 3 tại nồng độ 100 µg/mL đều cho giá trị tin cậy, với giá trị RSD thấp (< 2%) (Bảng 1). Do đó, phương pháp phân tích tương thích với hệ thống.
Phân tích các mẫu chuẩn 1, 2, 3, mẫu dược liệu và mẫu trắng trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn. Trên sắc ký đồ các pic chất chuẩn trên tương ứng với mẫu dược liệu, đồng thời không xuất hiện trên pic mẫu trắng. Trên sắc ký đồ, các pic của 1, 2, 3 tách nhau hoàn toàn, cân đối, sắc nét, độ rộng chân píc nhỏ. Như vậy, phương pháp phân tích lựa chọn có tính đặc hiệu và chọn lọc.
3.3.2. Khoảng tuyến tính, LOD và LOQ
Khoảng tuyến tính của phương pháp được xây dựng ở 8 nồng độ từ 250 µg/mL tới 1,95 µg/mL. Các giá trị LOD và LOQ của 1, 2, 3 được xác định tại nồng độ của tín hiệu chất phân tích trên tín hiệu nền lần lượt bằng 3 (S/N) và 10 (S/N). Kết quả phân tích như Bảng 2.
Bảng 2. Các tham số của phương trình tuyến tính, LOD, LOQ các chất 1, 2 và 3
| Chất chuẩn | Nồng độ(μg/mL) | Độ dốc(a) | Hệ số chặn(b) | Hệ số tương quan (R2) | LOD(μg/mL) | LOQ(μg/mL) |
| 1 | 1,95-250 | 29.712 | – 68.767 | 0,9994 | 0,430 | 1,435 |
| 2 | 1,95-250 | 30.612 | – 53.681 | 0,9994 | 0,080 | 0,267 |
| 3 | 1,95-250 | 49.616 | – 95.833 | 0,9997 | 0,060 | 0,200 |
Kết quả khảo sát cho thấy, tại khoảng nồng độ (250; 125; 62,5; 31,25; 15,625; 7,5125; 3,90; 1,95 µg/mL, mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của các chất chuẩn 1, 2, 3 tuyến tính với R2 từ 0,9994 – 0,9997 (Bảng 2).
Hình 1. Sắc ký đồ của hỗn hợp chất chuẩn (A): puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) và SD1 (B).
3.3.3. Độ đúng, độ chính xác
Độ đúng và độ chính xác được xác định bởi phân tích 6 mẫu độc lập tại 3 nồng độ khác nhau (Bảng 3).
Bảng 3. Kết quả của độ đúng và độ chính xác
| Chất phân tích | Chuẩn thêm vào | Nồng độ mẫu(μg/mL) | Trong ngày (n=6) | Nồng độ mẫu(μg/mL) | Các ngày tiếp theo (n=6) | ||||||
| Nồng độ thu được(μg/mL) | SD | Độ đúng(%) | Độ chính xácRSD% | Nồng độ thu được(μg/mL) | SD | Độ đúng(%) | Độ chính xácRSD% | ||||
| 1 | 2 | 88,8 | 90,8 | 0,07 | 100,1 | 3,7 | 88,3 | 28,4 | 0,05 | 100,1 | 1,72 |
| 50 | 88,8 | 138,1 | 1,8 | 98,6 | 3,5 | 88,3 | 77,1 | 0,14 | 98,2 | 0,71 | |
| 100 | 88,8 | 187,8 | 1,79 | 99,0 | 1,7 | 88,3 | 227,1 | 0,37 | 100,1 | 0,49 | |
| 2 | 2 | 16,7 | 18,7 | 0,04 | 99,2 | 2,0 | 16,80 | 18,7 | 0,1 | 98,6 | 4,08 |
| 50 | 16,7 | 66,6 | 1,3 | 99,7 | 2,6 | 16,80 | 66,4 | 1,2 | 99,4 | 0,32 | |
| 100 | 16,7 | 115,9 | 2,1 | 98,5 | 2,1 | 16,80 | 117,3 | 2,0 | 100,6 | 0,49 | |
| 3 | 2 | 24,5 | 26,5 | 0,1 | 101,1 | 2,6 | 24,5 | 26,5 | 0,31 | 101,5 | 2,3 |
| 50 | 24,5 | 74,4 | 0,9 | 99,8 | 1,7 | 24,5 | 73,0 | 0,10 | 97,0 | 3,1 | |
| 100 | 24,5 | 125,6 | 2,6 | 98,8 | 2,2 | 24,5 | 125,9 | 0,30 | 101,4 | 1,0 | |
Kết quả phân tích cho thấy độ đúng của 1, 2, 3 của các mẫu phân tích trong ngày từ 98,6 – 101,1% và các ngày liên tiếp từ 97,0 – 101,5%. Đối với độ chính xác 1,7 – 3,7% của mẫu phân tích trong ngày và các ngày liên tiếp từ 0,32 – 4,08%. Kết quả trên cho thấy phương pháp phân tích có độ đúng và chính xác cao.
3.4. Áp dụng phân tích các mẫu sắn dây thu hái trên địa bàn tỉnh Phú Thọ
Năm mẫu rễ của sắn dây trồng trọt (SD1-SD5) được thu hái tại các địa điểm khác nhau trong tỉnh Phú Thọ được khảo sát đồng thời hàm lượng 1, 2, 3 dựa vào các điều kiện nghiên cứu ở trên cho kết quả ở Bảng 4 dưới đây.
Bảng 4. Khảo sát hàm lượng 1, 2, 3 trong 5 mẫu sắn dây
| Chất | SD1
(% kl/kl) |
SD2(% kl/kl) | SD3(% kl/kl) | SD4(% kl/kl) | SD5(% kl/kl) |
| 1 | 1,48 | 0,41 | 0,11 | 0,10 | 1,69 |
| 2 | 0,28 | 0,11 | 0,06 | 0,07 | 0,12 |
| 3 | 0,41 | 0,09 | 0,08 | 0,09 | 0,08 |
SD2 – SD5 được thu hái tại huyện Cẩm Khê – Phú Thọ.
Từ Bảng 4 cho thấy, các mẫu SD1, SD2 và SD5 có hàm lượng puerarin lớn hơn 0,3%, đạt yêu cầu theo Dược điển Trung Quốc về chuyên luận P. thomsonii. Tuy nhiên, 2 mẫu SD3 và SD4 có hàm lượng puerarin thấp 0,10 – 0,11%. Trong y học cổ truyền của Trung Quốc, dược liệu cát căn (Puerariae Radix) gồm Puerariae lobatae Radix và Puerariae thomsonii Radix được chia ra hai chuyên luận từ năm 2005 do hàm lượng puerarin khác nhau đáng kể [2]. Các nghiên cứu cũng chỉ ra tác dụng chống oxy hóa và một số tác dụng dược lý giữa hai taxon này cũng tương đối khác nhau [6]. Dựa trên hình thái học thực vật, hai taxon này giống nhau, chỉ phân biệt dựa trên kích thước các bộ phận của hoa, quả [7]. Hàm lượng hoạt chất chính có tác dụng sinh học là các isoflavonoid giữa chúng cũng khác nhau nhiều. Để phân biệt dược liệu Puerariae lobatae Radix và Puerariae thomsonii Radix, các nghiên cứu chỉ ra đặc điểm khác nhau về hình thái học, đặc điểm hiển vi và thành phần hóa học của chúngtrên TLC, HPLC [7],[8],[9]. Kết quả nghiên cứu của Du G. và cs. [10], phân biệt hai taxon trên dựa trên thành phần hóa học, cho thấy P. thomsonii có hàm lượng puerarin từ 0,37% – 0,698%, trong khi đó P. lobata từ 2,92% – 6,13%. Trong nghiên cứu này, các mẫu thu hái có hàm lượng puerarin từ 0,1 – 1,69% phù hợp với các công trình nghiên cứu phân biệt giữa hai dược liệu trên.
4. Kết luận
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát, lựa chọn các các điều kiện chiết xuất isoflavonoid rễ củ sắn dây với hiệu suất cao, an toàn với dung môi EtOH 35%, phương pháp siêu âm với thời gian là 60 phút. Đồng thời xây dựng thành công phương pháp định lượng đồng thời puerarin (1), daidzin (2), daidzein (3) đơn giản, thời gian ngắn và chính xác. Phương pháp được thẩm định với các giá trị độ đúng từ 97,0 – 101,5% và độ chính xác 0,32 – 4,08%. Phương pháp này góp phần tiêu chuẩn hóa về mặt định lượng các chất chính trong dược liệu cát căn.
Tài liệu tham khảo
- Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Tập 2, Nhà xuất bản Y học, 1310-1311. Pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2010), Chinese Pharmacopoeia Com-mission, Vol 1. People’s Medical Publishing House, Beijing, China, 313-321. 3. Zhang Z., Lam T. N., Zuo Z. (2013), Radix Puerariae: An overview of its chemistry, pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use, The Journal of Clinical Pharmacology, 53(8), 787-811. 4. Wong K. H., Li G. Q., Li K. M., Razmovski N. V., Chan K. (2011), Kudzu root: Traditional uses and potential medicinal benefits in diabetes and cardiovascular diseases, Journal of Ethnopharmacology, 134(3), 584-607. 5. ICH (1995), Validationofanalyticalprocedures: Text and methodology ICH guidelines topic Q2 (R1), London, UK. 6. Wong K. H., Razmovski N. V., Li K. M., Li G. Q., Chan K. (2015), Comparing morphological, chemical and anti-diabetic characteristics of Puerariae lobatae Radix and Puerariae thomsonii Radix, Journal of Ethnopharmacology, 164, 53-63. 7. Zhengyi W., Reven P. H, Deyuan H. (2010), Flora of China, Vol. 10, Science Press (Beijing) and Missouri Botanical Garden Press (St. Louis), 244-248. 8. Jiang R. W., Lau K. M., Lam H. M., Yam W. S., Leung L. K., Choi K. L., Waye M. M., Mak T. C., Woo K. S., Fung K. P. (2005), A comparative study on aqueous root extracts of Pueraria thomsonii and Pueraria lobata by antioxidant assay and HPLC fingerprint analysis, Journal of Ethnopharmacology, 96(1), 133-138. 9. Zhang C. L., Ding X. P., Hu Z. F., Wang X. T., Chen L. L., Qi J., Yu B. Y. (2011), Comparative study of Puerariae lobatae and Puerariae thomsonii by HPLC-diode array detection-flow injection-chemiluminescence coupled with HPLC-electrospray ionization-MS”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 59(5), 541-545. 10. Du G., Zhao H. Y., Zhang Q. W., Li G. H., Yang F. Q., Wang Y., Li Y. C, Wang Y. T. (2010), A rapid method for simultaneous determination of 14 phenolic compounds in Radix Puerariae using microwave-assisted extraction and ultra high performance liquid chromatography coupled with diode array detection and time-of-flight mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1217(5), 705-714.
Giới thiệu: Sản phẩm Nhựa hấp phụ Macroporous D101 là một copolymer không phân cực loại styrene (tác nhân liên kết chéo là divinylbenzene, porogen là toluene và octanol). Nó có một loạt các ứng dụng. Đối với các hợp chất hữu cơ không phân cực hoặc phân cực yếu, nó có khả năng hấp phụ mạnh, đặc biệt là để tách và phân lập saponin. Nó cũng thích hợp cho flavonoid và alkaloid. Ví dụ: ginsenoside, Panax notoginseng saponin, diosgenin, ginkgo flavone.
Ứng dụng: Sử dụng để tinh chế các sản phẩm Ginsenoside, Panax notoginseng saponin, diosgenin và ginkgo flavone.
Thông số sản phẩm:
Độ ẩm: 65-75 (%).
Mật độ thực: 1.15-1.19 (g/ml).
Kích thước: 0.315-1.25mm
Bề mặt: Hình cầu
Đơn vị đóng gói: 0.8 Kg
Xuất xứ: YUNKAI – Trung Quốc
Đặt hàng ấn vào đây ĐẶT HÀNG NHỰA HẤP THỤ d101
